Разработаны новые биотехнологии направленного синтеза внеклеточных гидралаз при глубинном куль- тивировании отобранных и запатентованных штаммов микроскопических грибов: Trichoderma koningii CNMN FD 15 и Fusarium gibbosum CNMN FD 12 — продуцентов внеклеточных протеаз и Rhizopus arrhizus CNMN FD 03, Aspergillus niger CNMN FD 01 — продуцентов внеклеточ- ных липаз. Культуры хранятся в Национальной коллек- ции непатогенных микроорганизмов института микро- биологии и биотехнологии республики Молдова (1–6). Оригинальность и новизна технологических реше- ний при разработке новых биотехнологий заключа- лась в том, что при глубинном культивировании ми- кромицетов в качестве регуляторов и стимуляторов биосинтеза ферментов использовались наноматери- алы. Возможность использования наноматериалов в технологических целях заключается в том, что многие соединения в наноразмерном состоянии приобрета- ют новые свойства и становятся весьма активными в биологическом отношении, что делает перспективным их применение в медицине, фармакологии, производ- стве продуктов питания, при решении экологических и сельскохозяйственных проблем. Для повышения био- синтетических способностей продуцентов была про- тестирована большая группа наноокислов металлов, из числа которых индивидуально для каждого штамма были отобраны наиболее перспективные наночастицы; выявлены их оптимальные размеры и концентрации: •• для Trichoderma koningii CNMN FD 15 — наноча- стицы ZnO, с оптимальными размерами 30 нм, в концентрациях 5–10 мг/л среды; •• для Fusarium gibbosum CNMN FD 12 — наночасти- цы Fe3O4, с оптимальными размерами 65–70 нм, в концентрации 10 мг/л среды; •• для Aspergillus niger CNMN FD 01 — наночастицы TiO2, с оптимальными размерами 40 нм, в концен- трации 10 мг/л среды; •• для Rhizopus arrhizus CNMN FD 03 — наночасти- цы Fe3O4, с оптимальными размерами 70 нм, в концентрации 5–10 мг/л среды. Наночастицы вносились в посевной материал не- посредственно перед посевом. Предварительно они несколько раз обрабатывались на ультразвуковой бане DA–96 DADi в течение 1–2 мин. до полного растворе- ния конгломератов. Глубинное культивирование продуцентов осущест- влялось на средах подобранного состава: •• для Trichoderma koningii CNMN FD 15 и Fusarium gibbosum CNMN FD 12 (г/л): отруби пшеничные — 20,0; соевая мука — 10,0; CaCO3–2,0; (NH4)2SO4–1,0; H2O — 1,0 л; рН 6,25; •• для Aspergillus niger CNMN FD 01 и Rhizopus arrhizus CNMN FD 03 (г/л): соевая мука — 35,0; KH2PO4–5,0; (NH4)2SO4–1,0; H2O — 1,0 л; рН 7,2. Использование наноокислов металлов в процессах глубинного культивирования продуцентов обеспечи- вало возникновение стимулирующего эффекта, уро- вень которого у штаммов был различным в зависимо- сти от их физиолого-биохимических особенностей и свойств синтезируемых ими ферментных комплексов. У штаммов Trichoderma koningii CNMN FD 15 и Fusarium gibbosum CNMN FD 12 было установлено увеличеТехнологическая схема получения ферментных препаратов про- теолитического и липолитического действия при глубинном культивировании микромицетов T. koningii CNMN FD 15, F. gibbosum CNMN FD 12, A. niger CNMN FD 01, R. arrhizus CNMN FD 03 в присутствии подобранных наноокислов металлов ние энзиматической активности всех трех типов про- теаз, входящих в состав их ферментных комплексов, соответственно, по сравнению с максимальными кон- тролями: •• на 25,9% и 17,7% (кислые протеазы); •• на 192,6% и 48,1% (нейтральные протеазы); •• на 12,9% и 14,3% (щелочные протеазы). Период максимального накопления ферментов при этом не изменяется, составляя 9 суток и 5 суток, соот- ветственно. У микромицета Rhizopus arrhizus CNMN FD 03 ис- пользование наночастиц Fe3O4 обеспечивает значи- тельное усиление липолитической активности в 3 раза по сравнению с максимальным контрольным вариан- том; а у штамма Aspergillus niger CNMN FD 01 липоли- тическая активность увеличивается на 55,3–57,5% при использовании наночастиц TiO2. Период максимально- го накопления внеклеточных липаз составил 3 суток и 5 суток, соответственно. При разработке новых биотехнологий не менее важным представляется подбор оптимальных условий выделения ферментных препаратов из культуральной жидкости (КЖ) продуцентов, обеспечивающих их мак- симальный выход и сохраняющих высокий уровень эн- зиматической активности: •• соотношение КЖ и этилового спирта (в качестве осадителя) — 1:4; •• продолжительность их контакта — 2 часа; •• оптимальные (для полноты осаждения) значения рН культуральной жидкости: рН 8,0 (Trichoderma koningii CNMN FD 15); рН 5,0 и 8,0 (Fusarium gibbosum CNMN FD 12 — два различных значения рН позволяют получать ферментные препараты с разным соотношением кислых и щелочных проте- аз); рН 7,0 (Rhizopus arrhizus CNMN FD 03); рН 7,2 (Aspergillus niger CNMN FD 01). Установлено, что оптимально подобранные условия выделения ферментных препаратов являются идентич- ными как для контрольных, так и для оптимизирован- ных препаратов. При этом стимулирующий эффект, полученный от использования наночастиц, после вы- деления препаратов из культуральной жидкости, со- храняется практически на достигнутом уровне. Основные этапы направленного синтеза внеклеточ- ных гидралаз при глубинном культивировании микро- мицетов с использованием наноматериалов представ- лены на схеме. Синтезированным и выделенным в подобранных условиях ферментным препаратам была дана физи- ко-химическая характеристика, включающая опреде- ление: •• рН оптимумов их действия; •• рН стабильности; •• температурных оптимумов действия; •• термостабильности. Полученные результаты свидетельствуют о том, что новые биотехнологии с использованием наноматери- алов обеспечивают повышенный уровень биосинтеза внеклеточных протеаз и липаз (в лучших вариантах в 1,5; 2,0 и даже 3 раза) и высокое качество получаемых ферментных препаратов с улучшенными физико-хи- мическими свойствами (по сравнению с контрольными препаратами): более расширенными рН оптимума- ми действия внеклеточных протеаз и липаз, особенно в кислой области рН; достаточно высокой рН- и тер- мостабильностью, включающей способность восста- навливать свою исходную активность после термо- обработки в течение 60 мин при высоких температурах (60–80ºС). Список литературы 1. Deseatnic-Ciloci A., Tiurina J., Bivol C. et al. Tulpina de fungi Trichoderma koningii Oudemans CNMN FD 15 — producatoare de proteaze acide, neutre şi alcaline. Brevet de invenţie MD 4285. 2014.05.31. 2. Deseatnic-Ciloci A., Tiurina J., Guţul T. et al. Procedeu de cultivare a tulpinii de fungi Trichoderma koningii CNMN FD 15. Brevet de invenţie MD 4445. 2017.06.03. 3. Deseatnic-Ciloci A., Tiurina J., Lupaşcu G. et al. Tulpina de fungi Fusarium gibbosum CNMN FD 12 producător de proteaze acide şi neutre, xilanaze şi β-glucozidaze. Brevet de invenţie MD 4186. BOPI 11/2012. 4. Ciloci A., Bivol C., Tiurina J. et al. Procedeu de cultivare a tulpinii de fungi Aspergillus niger CNMN FD 01 producătoare de lipaze. Brevet de invenţie MD 4566. În: BOPI 2018.05.31, p. 42–43. 5. Deseatnic-Ciloci A., Sîrbu T., Tiurina J., Labliuc S. Tulpina de fungi Aspergillus niger producătoare de enzime lipolitice. Brevet de invenţie MD 2362. În: BOPI 2004.01.31, p. 32. 6. Deseatnic-Ciloci A., Sîrbu T., Tiurina J., Labliuc S. Tulpina de fungi Rhizopus arrhizus Fisher 67 — producătoare de enzime lipolitice. Brevet de invenţie MD 2458. BOPI №1, 2004.