В работе исследовали изменения морфологии нейрональной сети и созревание митохондрий в
первичной культуре гранулярных клеток мозжечка крыс. Развитие нейронов из мозжечка 7-дневных самцов
крыс породы Вистар регистрировали с интервалом 20 мин в течение 2,5 недель со дня посадки клеток с
помощью системы визуализации и анализа изображений IncuCyte ZOOM, оптический блок которой
постоянно находился в СО2-инкубаторе. Нейроны были посажены с плотностью 3•105 клеток/лунку.
Царапина шириной ≈ 1 мм была нанесена на монослой клеток спустя 23 часа после посадки. Обнаружено,
что в процессе роста нейритов (аксонов и дендритов) и изменений тел нейронов можно выделить три фазы.
(1) Быстрый рост нейритов в первые 3 суток развития культуры; вероятно, именно эти нейриты становятся
аксонами. (2) Медленный рост нейритов (4-8 сутки после посадки), когда образуются более короткие, но
многочисленные дендриты. (3) Третья фаза (более 8 суток) – объединение нейритов (аксонов) в пучки.
Одновременно с отслеживанием изменений морфологии мы наблюдали рост митохондриального
потенциала (ΔΨm) и числа митохондрий в соме нейронов, измеряя накопление в нейронах потенциал-
чувствительного флуоресцентного зонда TMRM. В изменениях флуоресценции TMRM также можно
выделить три фазы, которые по продолжительности совпадают с фазами изменений морфологии
нейрональной сети. В первые 3 суток в клетках мало митохондрий и их ΔΨm не достаточно высок для
синтеза АТФ. В этот период энергообеспечение развития нейрональной сети происходит, по-видимому, за
счет гликолиза. Во второй фазе (70-140 часов после посадки) происходил быстрый рост ΔΨm без
существенного увеличения количества митохондрий. В интервале 140-300 часов ситуация изменилась на
обратную – потенциал стал расти медленнее, а образование новых митохондрий и/или увеличение их
среднего относительного размера ускорялось. В третьей фазе (спустя 300 часов после посадки)
интенсивность стабилизировалась на максимальном уровне и митохондрии сосредоточились в
перинуклеарной зоне, в аксональных холмиках и возле мест отхождения дендритов от сомы. Таким
образом, непрерывный оптический мониторинг позволяет получить уникальную информацию о разных
стадиях развития нейрональной культуры.
Исследование поддержано грантами РФФИ 16-04-00792, РФФИ 17-00-00106 и РНФ 17-15-01487.

Changes in the morphology of the neuronal network and maturation of mitochondria in the primary culture of
the rat cerebellar granular cells were studied. The development of the primary culture of neurons from the
cerebellum of 7-day-old rats was recorded at 20 min intervals for 2.5 weeks from the day the cells were seeded
using the IncuCyte ZOOM's intravital imaging and analysis system equipped, which was constantly in the CO2
incubator. Neurons were planted at a density of 3•105 cells/well. Scratch (≈ 1 mm width) was applied to the
monolayer of cells 23 hours after plating. It was found that three phases can be distinguished in the growth of
neurites (axons and dendrites) and in the neuronal body changes. (1) Rapid growth of neurites in the first 3 days of
development of culture; probably, these neurites become axons. (2) Slow growth of neurites (4-8 days after
plating), when shorter but numerous dendrites are formed. (3) The third phase (more than 8 days) is the merge of
neurites (axons) into bundles. Simultaneously with monitoring morphology changes, we observed the growth of the
mitochondrial potential (ΔΨm) and the number of mitochondria in the neuronal soma by measuring the
accumulation of the potential-sensitive fluorescent probe TMRM. It was possible to distinguish three phases in the
changes of TMRM fluorescence, that coincided in duration with the phases of the morphology changes of the
neural network. There were few mitochondria in the cells for the first 3 days and ΔΨm was not sufficiently high for
the ATP synthesis. During this period the energy supply to the development of the neural network was apparently
provided by glycolysis. In the second phase (70-140 hours after planting) there was a rapid growth of ΔΨm without
a significant increase in the number of mitochondria. In the range of 140-300 hours, the situation reversed – the
potential began to grow more slowly, and the formation of new mitochondria and/or an increase in their mean
relative size was accelerated. In the third phase (300 hours after seeding) the intensity stabilized at the maximum
level and the mitochondria were concentrated in the perinuclear zone, in the axonal hillocks and near the sites of the dendrite outgrowth from the soma. Thus, continuous optical monitoring allows obtaining unique information
about the different stages of neuronal culture development.
The work was supported by grants of RFBR 16-04-00792, 17-00-00106, and grant of RSF 17-15-01487.