Лактоферрин (Лф) – полифункциональный белок из семейства трансферринов – широко представлен в различных секреторных жидкостях млекопитающих. Этот белок является ключевым защитным компонентом неспецифического врожденного иммунитета. Показано, что при ряде серьезных патологий центральной нервной системы, таких как болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера, наблюдается усиление экспрессии рецепторов ЛФ на мембранах церебральных эндотелиальных клеток, и нейронах, что указывает на возможный терапевтический эффект Лф. Целью исследования было изучение возможных путей транспорта экзогенного Лф в мозг мыши. В работе был использован человеческий Лф (чЛф), выделенный из женского молозива методами ионообменной и аффинной хроматографии. Мы использовали мышей-самцов линии C57Вl/6, в возрасте 2-3 месяцев, массой 25-30 г. Животных разделили на 4 экспериментальные группы по способу введения Лф: интраназально (по 5 мкл раствора в каждую ноздрю), конъюнктивально (дважды по 2,5 мкл раствора в каждый глаз); подъязычно (30 мкл) и внутрибрюшинно (0,4 мл). Животным 1, 2 и 3 групп чЛф вводился в физиологическом растворе в концентрации 20 мг/мл; животным 4 группы – в растворе фосфатного буфера в концентрации 10 мг/мл. Мыши 1, 2 и 3 групп были анестезированы перед введением растворов, мыши 4 группы – перед проведением перфузии. Через 5, 10 или 60 минут (для животных групп 1 и 2), через 5, 15 или 30 минут (для животных группы 3) и через 30 или 60 минут (для животных группы 4) после введения чЛф мышей транскардиально перфузировали и извлекали мозг для последующей иммуногистохимической детекции чЛф. На вибратоме Leica VT1200S готовили парасагиттальные срезы толщиной 50 мкм и проводили иммуногистохимическую реакцию на плавающих срезах по стандартной методике. Окрашенные срезы оцифровывали с помощью конфокального микроскопа Olympus FV10i и анализировали в программе Bitplane Imaris 7.4.2. Флуоресцентная иммуногистохимическая окраска показала, что ЛФч детектируется в мозге мыши после подъязычного (через 5, 15 и 30 минут), внутрибрюшинного (через 30 и 60 минут) и интраназального (через 10 и 60 минут) введения. В настоящей работе впервые были изучены различные пути введения человеческого Лф в мозг мыши. Используя метод флуоресцентной иммуногистохимии, мы определили наличие чЛф в мозге после интраназального, подъязычного и внутрибрюшинного введения. При конъюнктивальном введении чЛф не определялся. Полученные результаты показывают, что интраназальный путь введения является предпочтительным и неинвазивным методом для транспорта чЛф в мозг.
Lactoferrin (Lf) is a multifunctional protein of the transferrin family that is widely represented in various secretory fluids of mammals. This protein is a key protective factor of nonspecific innate immunity system. It was demonstrated that overexpression of Lf receptors on endothelial cerebral cell membranes and neurons is associated with a number of serious neurodegenerative diseases, such as Parkinson’s and Alzheimer’s diseases, which indicates a potential therapeutic effect of Lf. The objective of our research was to study potential ways of endogenous LF transport into the mouse brain. For our work we have used human Lf (hLf) isolated from female colostrum by ion exchange and affinity chromatography methods. C57Вl/6 male mice (age: 2-3 months; weight 25-30 g) were used for the experiments. Animals were divided to four experimental groups depending on way of hLf administration: intranasal (5 μl per each nostril), conjunctival (twice, 2,5 μl per each eye), sublingual (30 μl) and intraperitoneal (0,4 ml). Mice from 1st, 2nd and 3rd groups were treated with hLf dissolved in saline (20 mg/ml). Mice from 4th group were injected with hLf dissolved in sodium phosphate buffer (PBS, pH 7.4; 10 mg/ml). Animals from 1st, 2nd and 3rd groups were anesthetized before hLf administration, animals from 4th group – before perfusion. 5, 10 or 60 min (mice from 1st and 2nd groups); 5, 15 or 30 min (mice from 3rd group) and 30 or 60 min (mice from 4th group) after hLf administration animals were perfused with 4% paraformaldehyde in PBS (pH 7.4). Whole brains were removed and parasagittal 50 μm sections were cut on Leica VT1200S vibratome. Immunohistochemical analysis of hLf was performed on floating sections according to standard protocols. Fluorescently immunolabeled sections were imaged on confocal microscope Olympus FV10i and analyzed with Bitplane Imaris 7.4.2 software. Fluorescent immunohistochemical staining had shown that hLf was detected after sublingual (5, 15 and 30 min), intraperitoneal (30 and 60 min) and intranasal (10 and 60 min) administration in the mouse brain. Present study is the first to explore different ways of human Lf administration into the mouse brain. Using fluorescent immunohistochemical staining method, we have visualized hLf in the mouse brain after intranasal administration, as well as after sublingual and intraperitoneal. No conjunctival delivery was detected. Taken together, these results demonstrate that nose-to-brain delivery presents an effective and non-invasive way of Lf transport.
|