Один из наиболее доступных и широко используемых методов определения инулина в растительном сырье основан на цветной реакции с резорцином в сильно кислой среде. При этом последовательно протекают процессы гидролиза инулина до мономеров, дегидратации фруктозы и конденсации образующегося фурфурола с резорцином. С целью исключения влияния на результат низкомолекулярных фруктозидов, последние обычно предварительно извлекают из образца 95% этанолом при кипячении [1-4], либо проводят параллельную экстракцию двух навесок водой (сумма фруктозидов и фруктозанов) и 95% этанолом (фруктозиды), а содержание инулина определяют по разности измерений [4, 5]. Последний вариант, как более быстрый в выполнении, и лег в основу данной разработки. Попытка применить его к анализу клубней топинамбура выявила существенную систематическую погрешность: результат определения инулина оказался значительно ниже, чем его количество, препаративно выделенное из той же партии клубней. Другим очевидным, хоть и менее критичным, недостатком методики является длительность, трудоемкость и материалоемкость пробоподготовки, включающей трехкратную экстракцию, а применение на этом этапе нагревания с обратным холодильником затрудняет одновременную подготовку большого числа проб. Целью данной работы стало выявление и устранение причин систематической ошибки, а также оптимизация методики в направлении сокращения числа операций, затрат времени и реактивов. Материалы и методы. В качестве исследуемого растительного материала были использованы клубни дикорастущего топинамбура, собранные в начале октября в центральной части Республики Молдова. Для исследования свежие клубни нарезали пластинками, сушили при 40°C, измельчали и просеивали через сито (0,5 мм). Измерение оптической абсорбции продуктов цветной реакции выполняли на спектрофотометре Lambda 25 (Perkin Elmer) при длине волны 480 нм. Результаты и дискуссия. Исследования были выполнены в 2 этапа: 1. Оптимизация условий выполнения цветной реакции. Большинство авторов выполняют реакцию с резорцином в среде этанол – соляная кислота. Пробы нагревают на водяной бане при 100°C, а для стабилизации окрашенного продукта в реакционную смесь вводят тиомочевину. При таких условиях наблюдается частичное выкипание спирта и плохо воспроизводимое изменение состава реакционной смеси. Для уменьшения связанной с этим случайной погрешности используют значительные объемы (20 мл) реакционной смеси [1]. С целью снижения потерь спирта мы проводили реакцию при температуре 80°C в узкогорлых мерных колбах вместимостью 10 мл. Тем самым удалось уменьшить необходимый объем реакционной смеси до 1 мл при сохранении хорошей сходимости результатов (коэффициент вариации составил 0,34% для

раствора инулина, 2 мг/мл). В этих условиях максимальные значения аналитического отклика наблюдались в интервале 30-40 мин (Рис. 1). При этом обнаружилось, что добавление тиомочевины в реакционную смесь не влияет на форму кинетической кривой, а лишь незначительно снижает выход окрашенного продукта, в связи с чем использование тиомочевины мы исключили из методики, а все остальные реактивы вводили в составе одного раствора.

2. Оптимизация способа подготовки проб. Поскольку экстракция сырья 95% этанолом фактически происходит при температуре кипения смеси (около 80°C), мы отказались от кипячения с обратным холодильником, заменив его нагреванием на водяной бане при 80°C с периодическим перемешиванием, решив тем самым проблему параллельной подготовки большого числа проб. Вторым шагом была замена трехкратной последовательной экстракции с объединением всех фракций экстракта однократной равновесной экстракцией в заданном объеме, включающем внутренний объем частиц образца. Для определения необходимого времени проведения процесса была исследована кинетика экстракции клубней топинамбура водой и этанолом различной концентрации. Отобранные пробы выдерживали 30 мин при 4°C, затем центрифугировали. Как видно из кинетических графиков (Рис. 2), скорость массопереноса и равновесная полнота извлечения снижаются с ростом концентрации спирта, но даже в 95% этанол при длительной экстракции переходит большая часть всех водорастворимых сахаров. При этом представляется очевидным, что различия в полноте извлечения из клубней не могут быть обусловлены лишь различной растворимостью инулина в использованных растворителях. Тот же феномен мы

наблюдали при экстракции свежих измельченных клубней, в то время как чистый инулин, равно как и инулин, смешанный перед экстракцией с порошком клубней топинамбура, показал очень низкую растворимость в данных условиях. Это позволило исключить гидролиз инулина в процессе сушки образца, либо его экстракции, из возможных причин наблюдаемого явления, а в качестве наиболее вероятного

Рис. 2. Кинетика экстракции фруктозо- содержащих сахаров из клубней топинамбура и чистого инулина водно-этанольными смесями при 80°C.

механизма мы рассматриваем солюбилизацю инулина другими компонентами образца, предположительно кислого характера. Последнее предположение косвенно подтверждается тем, что перешедший в раствор инулин можно количественно осадить подщелачиванием экстракта гидроксидами щелочных или щелочноземельных металлов, оставив низкомолекулярные сахара в растворенном состоянии. При этом стало возможным, за счет снижения концентрации этанола в экстрагенте до 90%, уменьшить необходимое время экстракции до 20-30 мин. Замена водно-спиртового экстрагента 90%-ным ацетонитрилом также эффективно подавляет солюбилизацию. При этом подщелачивать экстракт не требуется, однако, из-за более низкой точки кипения ацетонитрила, пришлось снизить температуру до 75°C, увеличив время экстракции до 45 мин. Оба варианта дают близкие результаты определения инулина, но, учитывая более низкую токсичность и стоимость этанола, мы предпочли вариант с его использованием и разработали следующую методику: В 2 мерные колбы вместимостью 100 мл помещают по 0,6 г измельченных клубней топинамбура, навески уточняют до 0,001 г. В первую колбу прибавляют 95 мл 90% этанола, во вторую – такой же объем воды. Колбы выдерживают в течение 30 мин на водяной бане при 80°C, периодически перемешивая их содержимое. После охлаждения в колбу с этанолом вводят 0,5 мл 25% раствора натрия гидроксида, затем содержимое обеих колб доводят до 100 мл соответствующими растворителями, после тщательного перемешивания оставляют на 10-20 мин и аликвоты центрифугируют 3-5 мин при 4000-6000 g. В мерные колбы вместимостью 10 мл вносят по 0,05 мл центрифугатов обоих экстрактов (пробы), а так же раствора фруктозы, 3 мг/мл (стандарт) и воды (контроль), прибавляют по 1 мл реактива (2 мг/мл резорцина в смеси равных объемов 96% этанола и концентрированной соляной кислоты). Колбы выдерживают 35 мин на водяной бане при 80°C, охлаждают, объем доводят водой до 10 мл и перемешивают. Измеряют оптическую абсорбцию проб и стандартного раствора против контроля при длине волны 480 нм. Содержание фруктозо-содержащих сахаров в пробах (X, %) в пересчете на фруктозу рассчитывают по формуле: st pr pr st st pr pr st A m A C A m A C X           10 1000 100 100 , где Apr и Ast – оптическая абсорбция пробы и стандартного раствора соответственно; Cst – концентрация стандартного раствора фруктозы, мг/мл; mpr – масса навески анализируемого образца клубней, г. При этом результат, полученный для водного экстракта, отражает общее содержание водорастворимых углеводов, для этанольного экстракта – содержание низкомолекулярных фруктозидов, а их разность дает искомое содержание инулина. Параллельные исследования по экстракции в выше указанных условиях измельченных клубней топинамбура, чистого инулина, фруктозы и модельных смесей этих компонентов подтвердили правильность получаемых результатов. Линейность отклика (R > 0,999) подтверждена для концентраций инулина до 4 мг/мл в экстракте, что соответствует 80% содержанию в сухом образце. Содержание инулина в сухих клубнях топинамбура, взятых из различных популяций, оказалось на уровне 52-61%, что существенно выше приводимых в литературе величин, при том что суммарное содержание фруктозидов и фруктозанов (59-65%), как и ожидалось, вполне согласуется с литературными данными [6]. Выводы. Обнаружен эффект солюбилизации инулина при экстракции клубней топинамбура водно-этанольными смесями, искажающий результаты

количественного анализа. Предложены способы устранения данного феномена.
Разработана сравнительно простая и быстрая методика определения инулина на
основе цветной реакции с резорцином в кислой среде.
Библиография.
1. Оленников Д.Н., Танхаева Л.М. Исследование колориметрической реакции инулина с
резорцином в зависимости от условий ее проведения. Химия растительного сырья.
2008. № 1. С. 87-93.
2. Оленников Д.Н., Танхаева Л.М., Чехирова Г.В., Петров Е.В. Методика
количественного определения суммарного содержания полифруктанов в корневищах
и корнях девясила высокого (Inula helenium L.). Химия растительного сырья. 2008.
№1. С. 95–99.
3. Митрофанова И.Ю., Яницкая А.В. Определение суммарного содержания
полифруктанов и динамики их накопления в корневищах и корнях девясила высокого
(Inula helenium L.), произрастающего в Волгоградской области. Химико-
фармацевтический журнал. 2013. Т. 47, № 3. С. 45-47.
4. Яницкая А.В., Митрофанова И.Ю. Исследования по стандартизации
инулинсодержащего лекарственного растительного сырья и противодиабетических
комплексов. Вестник ВолгГМУ. 2012. 4 (44). С. 80-82.
5. Яницкая А.В., Митрофанова И.Ю. Девясил высокий – перспективный источник
новых лекарственных средств. Вестник ВолгГМУ. 2012. 3 (43). С. 24-27.
6. Bagaoutdinova R.I., Fedoseyeva G.P., Okoneshnikova Т.F. Fructose-containing
carbohydrates in plants of different families: Localization and content. Chemistry and
Computational Simulation. Butlerov Communications. 2001. Vol.2. No.5. P. 13-16.