В условиях изменяющегося в последние десятилетия климата со- временное сельское хозяйство несет огромные убытки в связи с ши- роким распространением грибных инфекций, вызванных многочис- ленными видами грибов рода Fusarium и Alternaria. Вред, наносимый упомянутыми грибными патогенами, выражается не только в прямой потере урожая зерновых культур, но и в существенном снижении ка- чества зерна вследствие наличия в нем продуктов жизнедеятельно- сти данных патогенов – микотоксинов. Микотоксины являются веще- ствами первого класса опасности, концентрация которых в продуктах питания регламентируется нормативами ЕС, и вызывают большое количество заболеваний как человека, так и животных. Поэтому про- блема продовольственной безопасности для стран, являющихся экс- портерами зерна, должна включать в себя наряду с агротехническими мероприятиями и современные методы пресимтпоматической диа- гностики зараженности посевов озимых культур. В лаборатории молекулярной генетики Института генетики, фи- зиологии и защиты растений Республики Молдова был разработан метод ПЦР-диагностики грибковых инфекций, вызванных патогена- ми родов Fusarium и Alternaria на разных стадиях развития пшеницы (стадия кущения-отрастания, цветения, молочно-восковой спелости, полной спелости), без предварительного выделения патогена из зара- женных образцов и с использованием набора праймеров собственного дизайна. Сотрудниками лаборатории были сконструированы видо- специфичные праймеры для рода Alternaria (Alternaria alternata), для рода Fusarium (F. graminearum, F. oxysporum, F. culmorum, F. avenaceum, F. verticillioides). Образцы растений пшеницы местного сорта ‘Молдо- ва-11’ для выделения ДНК отбирались на опытных полях института. Выделение ДНК производили методом SDS-экстракции с модификаци- ями, очистка ДНК производилась методом CTAB, определение родовой и видовой принадлежности микромицетов осуществлялось методом nested-PCR. В процессе исследований осуществлялся подбор оптимальных тем- пературных и временных параметров для проведения амплификации образцов ДНК патогенов. Уже на стадии кущения-отрастания полево- го сезона 2017 г. при отсутствии видимых признаков поражения дан- ными микромицетами в образцах ДНК, выделенных из корневой шей- ки были обнаружены F. avenaceum. и F. verticillioides. Мультипраймерная nested-PCR для коамплификации ДНК-матриц Alternaria spp. и Fusarium spp. в образцах ДНК, выделенной из листьев на стадии стеблевания, не выявила наличие комплексной альтернариозно-фузариозной инфек- ции исследуемых образцов. Лишь в 30% образцов ДНК листьев был об- наружен Fusarium spp., вид которого не был идентифицирован с помо- щью имеющегося набора праймеров. На стадии завершения цветения при видимом отсутствии внешних признаков грибковых инфекций на посевах пшеницы мультипраймерная двухстадийная ПЦР показа- ла наличие Alternaria spp. и Fusarium spp. в 75% исследуемых образцов листьев. При анализе ДНК, выделенной из колосьев тех же растений, Fusarium spp. был обнаружен в 30% образцов, а Alternaria spp. – в 50%. На стадии молочно-восковой спелости в образцах пшеницы посред- ством метода nested-PCR было установлено изменение соотношения грибковых патогенов из разных таксонов, а именно – преобладание Alternaria spp. в сравнении с Fusarium spp. На стадии полного созревания используемый метод позволил вы- явить у сорта ‘Молдова 11’ преобладание альтернариозной инфекции в сравнении с фузариозной. Таким образом, использование метода nested-PCR позволяет с высокой степенью достоверности определять инфекции уже на ранних стадиях вегетации пшеницы, когда види- мые признаки инфицирования еще отсутствуют или не являются специфичными, что дает возможность своевременно и эффективно провести полевые обработки посевов системными фунгицидами. Рас- смотренный метод также может быть использован на карантинных терминалах для экспресс-тестирования партий зерновых на наличие инфекций, для мониторинга посевов зерновых и состояния собранно- го урожая в зернохранилищах.
|